Reagen untuk pemurnian dan isolasi asam nukleat synthol. Komposisi kit untuk isolasi DNA "DNA-sorb-PCR" Kumpulan reagen untuk isolasi RNA "RNA-Extran"

Larutan lisis 30 cm 3,

Larutan pencuci 1 30 cm 3,

Konsentrat untuk larutan pembersih 2 20 cm 3,

Suspensi sorben 2 cm 3,

Buffer elusi DNA 4 cm 3 .

Prosedur pelaksanaan:

Siapkan larutan pembersih 2 dengan mencampurkan 20 cm 3 konsentrat dari kit, 80 cm 3 air suling dan 100 cm 3 etanol 96% dalam botol terpisah. Simpan larutan pada suhu kamar dalam botol yang tertutup rapat.

Periksa kondisi sorben - ketika mengendap, sorben harus menempati sekitar setengah volume suspensi.

Ke dalam tabung polipropilen 1,5 cm 3 yang tertutup rapat (sebaiknya dengan tutup ulir), tambahkan 100 μl sampel uji yang telah disiapkan sebelumnya, sampel negatif atau positif, tambahkan 300 μl larutan lisis (ke setiap sampel dengan ujung terpisah) dan campur secara menyeluruh dengan memipet 3-10 kali.

Tambahkan 15 - 20 μl sorben yang diresuspensi, aduk rata dengan pusaran, masukkan ke dalam rak selama 5-7 menit agar sorben benar-benar mengendap.

Endapkan sorben dalam mikrosentrifugasi selama 30 detik dengan kecepatan 3-8 ribu rpm. Ambil supernatan dari setiap tabung menggunakan ujung yang terpisah (akan lebih mudah jika menggunakan pengisap vakum).

Tambahkan 300 µl larutan pencuci 1, aduk dengan cara divorteks sampai sorben tersuspensi kembali seluruhnya (bila sorben rusak parah, hancurkan dengan pipet), diamkan dalam centrifuge dengan kecepatan 4-8 ribu rpm selama 30 detik. Kumpulkan supernatan dari masing-masing tabung menggunakan ujung yang terpisah.

Tambahkan 800 μl larutan pencuci 2, pusaran hingga sorben tersuspensi kembali sepenuhnya, sedimen dalam mikrosentrifugasi dengan kecepatan 6-10 ribu rpm selama 30 detik, dan kumpulkan supernatan.

Ulangi langkah 6, pilih supernatan dengan hati-hati, keringkan sedimen sorben dalam termostat pada suhu 65 °C selama 5 menit.

Suspensikan kembali sorben dalam 30-40 μl buffer elusi, tempatkan dalam termostat pada suhu 65°C selama 5 menit, kocok secara berkala dengan pusaran.

Endapan dalam microcentrifuge dengan kecepatan maksimum selama 1 menit.

Sampel siap untuk PCR; supernatan mengandung DNA yang dimurnikan.

Sebagai kontrol negatif pada tahap ekstraksi DNA, perlu menggunakan air garam atau air deionisasi.

Efisiensi ekstraksi DNA menggunakan kit DNA-sorb-PCR adalah 30 – 60%.

Materi klinis	Plasma, serum	Kerokan, sperma, pencuci faring, urin	Biopsi, darah, feses
Jumlah pemipetan
Volume sorben
Tingkat deposisi sorben	8 ribu rpm	6 ribu rpm	3-4 ribu rpm
Volume eluen
Efisiensi ekstraksi DNA

5.2. Tahap 2. Menyiapkan komposisi kit PCR untuk amplifikasi PCR:

5x buffer reaksi.1000 µl (larutan kental, berwarna biru transparan)

Air deionisasi.2000 µl

Campuran nukleotida.500 µl

Taq polimerase.100 µl

Campuran primer.500 µl

Lilin untuk PCR.2000 μl

Kontrol positif: 100 μl

Kontrol negatif 100 μl

Minyak mineral 4000 µl

Kit ini disimpan pada suhu minus 20°C selama setahun.

Metode ekstraksi DNA mikrokolom cepat dirancang untuk ekstraksi DNA total dari darah, plasma, air liur, urin, kultur sel, dan pelet sel apa pun dalam buffer. Kemurnian tinggi dari DNA yang diisolasi memungkinkannya digunakan untuk semua jenis analisis.

waktu isolasi berkisar antara 30 hingga 45 menit tergantung jumlah sampel;

• pengikatan DNA yang efektif ke membran kolom memungkinkan Anda memperoleh hasil DNA tertinggi dari sampel;
• pemurnian tingkat tinggi dicapai berkat komposisi komponen larutan pelisis dan pencuci yang dioptimalkan;
• secara signifikan mengurangi fragmentasi dan hilangnya DNA selama pencucian dibandingkan dengan metode ekstraksi sorben lainnya;
• dimungkinkan untuk memekatkan DNA dengan mengurangi volume larutan elusi;
• Ekstraksi DNA pada kolom secara signifikan mengurangi konsumsi plastik tambahan;
• volume sampel maksimum - 200 μl;
• kit ini mengandung Proteinase K;
• kemurnian DNA yang diisolasi adalah 1,8-1,9 menurut rasio A260/A280;
• jumlah DNA yang diekstraksi tergantung pada jenis dan jumlah sampel. Hasil DNA dari 200 μl darah rata-rata 5-6 μg.

Kumpulan reagen untuk isolasi DNA genom "DNA-Extran"

Dengan menggunakan kit untuk isolasi DNA genom seri DNA-Extran, Anda dapat mengisolasi DNA dari berbagai bahan biologis: darah, kultur sel bakteri dan hewan, jaringan hewan dan tumbuhan segar, beku atau kering.

• ekstraksi DNA lengkap dari sel, meminimalkan kehilangan dan fragmentasi DNA selama pemurnian;
• DNA yang diisolasi memiliki tingkat kemurnian yang tinggi (rasio A260/A280 = 1,8-1,9) dan cocok untuk PCR, pencernaan restriksi, hibridisasi dan penelitian lainnya;
• kit ini tidak mengandung komponen yang berpotensi berbahaya seperti fenol dan kloroform, tidak memerlukan plastik dalam jumlah besar, dan tidak menghasilkan limbah beracun.

Kumpulan reagen untuk ekstraksi DNA pada partikel magnetik "M-Sorb-Tube"

Diadaptasi untuk isolasi DNA mikobakteri dari dahak, pencucian bronkus, cairan serebrospinal, eksudat, belang-belang, biopsi, urin, sekret saluran genital, dan kultur sel. Pra-pemrosesan bahan klinis dilakukan sesuai dengan prosedur standar untuk persiapan sampel untuk studi mikrobiologi (Perintah No. 109 dari Kementerian Kesehatan Federasi Rusia tanggal 21 Maret 2003 “Tentang peningkatan tindakan anti-tuberkulosis di bidang Federasi Rusia”, Lampiran 11 “Petunjuk untuk metode terpadu studi mikrobiologi untuk deteksi, diagnosis dan pengobatan tuberkulosis"). Untuk menonaktifkan bahan klinis, kami merekomendasikan penggunaan larutan inaktivasi A yang telah kami kembangkan.

Solusi A membunuh mikobakteri dalam waktu 12 jam dan mendisinfeksi bahan klinis, yang dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut (ekstraksi DNA, PCR, dll.). Solusi A diadaptasi secara khusus untuk pengobatan dahak dan sepenuhnya menggantikan prosedur standar menggunakan larutan NaOH-NALC dan memiliki sifat mukolisis yang luar biasa. Larutan Inaktivasi A meningkatkan hasil DNA dibandingkan dengan preparasi sampel NaOH-NALC standar.

Teknik isolasinya meliputi: lisis DNA dengan guanidine isothiocyanate, sorpsi DNA pada partikel magnetik, pengendapan DNA dengan sentrifugasi, tahapan pencucian dan elusi DNA. Dapat digunakan untuk mengisolasi DNA dari mikroorganisme lain.

penggunaan partikel magnetik berlapis silika gel sebagai sorben adalah format yang lebih berteknologi maju dan nyaman dibandingkan dengan sorben lainnya dan memungkinkan standarisasi dan otomatisasi maksimum teknik ekstraksi DNA;

Kontrol positif internal (IPC) ditambahkan ke setiap sampel uji; ada/tidaknya inhibitor RT-PCR dan efisiensi ekstraksi DNA ditentukan oleh reaksi amplifikasi IPC.

Kit reagen untuk ekstraksi DNA dari produk makanan dan bahan baku makanan

Kit reagen “Sorb-GMO-A” dan “Sorb-GMO-B” dirancang khusus untuk ekstraksi DNA dari bahan tanaman, produk makanan, dan pakan. Kedua kit menggunakan sorben silikon untuk pemurnian DNA. “Sorb-GMO-A” mengandung guanidin klorida sebagai zat pelisis, “Sorb-GMO-B” adalah deterjen ionik CTAB, yang memberikan hasil DNA maksimum dari komponen tanaman. Ciri khas kit Sorb-GMO-A adalah kecepatan ekstraksi DNA dan tidak adanya kloroform, sehingga penggunaan kit ini lebih aman.

Kumpulan reagen untuk ekstraksi DNA dari sampel air (pada partikel magnetik) "M-Sorb-Leg"

Dirancang untuk isolasi DNA Legionella dari badan air lingkungan (menara pendingin, kolam renang, taman air, sistem pasokan air panas dan dingin). Konsentrasi minimum Legionella yang diisolasi adalah 100 sel per 0,5 liter sampel.

Kit “M-Sorb-Leg” tersedia dalam dua modifikasi: “M-Sorb-Leg1000” untuk sampel air dengan volume 1-1000 ml dan “M-Sorb-Leg1” untuk sampel air dengan volume hingga 1ml. Set M-Sorb-Leg1000 menyediakan penyaringan air menggunakan filter polikarbonat.

set reagen M-Sorb-Leg memungkinkan Anda menghilangkan inhibitor PCR yang ada dalam sampel air yang sangat terkontaminasi;

• Teknik isolasi DNA didasarkan pada penyerapan DNA pada partikel magnetik berlapis silika gel yang dilanjutkan dengan pengendapan dengan reagen pengendap. Menggabungkan keunggulan metode penyerapan dan metode pengendapan total;
• Kontrol positif internal (IPC) ditambahkan ke setiap sampel uji; ada/tidaknya inhibitor RT-PCR ditentukan oleh reaksi amplifikasi IPC.

Kumpulan reagen untuk ekstraksi DNA dari objek lingkungan (pada partikel magnetik) "M-Sorb-OOM"

Set reagen M-Sorb-OOM dimaksudkan untuk isolasi DNA dari objek lingkungan (tanah, air, bangkai hewan, dll.) yang diduga terinfeksi mikroorganisme berbahaya (DOM), guna mempersiapkannya untuk analisis selanjutnya dengan RT-PCR. Prosedur isolasi serupa dengan yang dijelaskan untuk kit M-Sorb-Leg.

Kumpulan reagen untuk isolasi RNA "RNA-Extran"

Kit ini dimaksudkan untuk mengisolasi RNA dari darah, fragmen jaringan, dan kultur sel. RNA yang diperoleh dengan menggunakan kit RNA-Extran dapat digunakan untuk RT-PCR dan untuk analisis hibridisasi, terjemahan in vitro, dan kloning.

Prinsip isolasi RNA didasarkan pada ekstraksi asam fenolik menurut Khomchinsky, di mana hanya RNA yang tersisa dalam fase air, dan DNA dalam kompleks dengan protein masuk ke fase organik. Guanidine tiosianat digunakan sebagai agen isolasi dan denaturasi untuk nuklease seluler.

memungkinkan Anda memperoleh RNA yang sangat murni, bebas dari pengotor DNA;

menyediakan ekstraksi lengkap RNA dari seluruh darah, fragmen jaringan dan kultur sel;

memungkinkan Anda mendapatkan RNA yang tidak rusak;

• Waktu isolasi RNA - 1 jam.

Nomor katalog	Nama	sejumlah reaksi
MANTAN-509	Kumpulan reagen "DNA-Extran-1" untuk isolasi DNA genom dari darah utuh	100
MANTAN-511	Kumpulan reagen "DNA-Extran-2" untuk ekstraksi DNA dari jaringan hewan dan manusia	100
MANTAN-512	Kumpulan reagen "DNA-Extran-3" untuk ekstraksi DNA dari kultur bakteri	100
MANTAN-513	Kumpulan reagen "DNA-Extran-4" untuk ekstraksi DNA dari jaringan tanaman	100
MANTAN-514	Kumpulan reagen “K-Sorb” untuk isolasi total DNA pada kolom (dari darah, air liur, urin, kultur sel, kerokan sel epitel)	100
MANTAN-515	Seperangkat reagen "RNA-Extran" untuk mengisolasi RNA dari darah, jaringan, kultur sel	50
OM-505	Kumpulan reagen “M-Sorb-Tub” untuk ekstraksi DNA dari sampel klinis dan kultur sel (pada partikel magnetik)	50 atau 100
GM-502-50	“SORB-GMO-A” (guanidine + sorbent) Kumpulan reagen untuk ekstraksi DNA dari bahan tanaman dan produk makanan	50
GM-503-50	“SORB-GMO-B” (CTAB+sorbent) Seperangkat reagen untuk ekstraksi DNA dari bahan tanaman dan produk makanan	50
OM-506	Set reagen “M-Sorb-Leg1000” untuk isolasi DNA Legionella dari sampel air hingga 1000 ml (pada partikel magnetik, filter disediakan terpisah)	50 atau 100
OM-507	Kumpulan reagen “M-Sorb-Leg1” untuk isolasi DNA Legionella dari sampel air dengan volume hingga 1 ml (pada partikel magnetik)	50 atau 100
OOM-502	Kumpulan reagen “M-sorb-OOM” untuk ekstraksi DNA dari objek lingkungan (pada partikel magnetik)	50 atau 100

Meminta informasi

Nama	Volume	Produksi	metode	Kucing.Tidak.
“GMO-MagnoSorb” (guanidine + magnetic sorbent) Kumpulan reagen untuk ekstraksi DNA dari bahan baku nabati dan produk makanan	50 alokasi	Sintol	PCR waktu nyata	GM-505-50
“SORB-GMO-A” (guanidine + sorbent) Kumpulan reagen untuk ekstraksi DNA dari bahan tanaman dan produk makanan	50	Sintol	PCR waktu nyata	GM-502-50-50
“SORB-GMO-B” (CTAB+sorbent) Seperangkat reagen untuk ekstraksi DNA dari bahan tanaman dan produk makanan	50	Sintol	PCR waktu nyata	GM-503-50-50
Set reagen “Amplitub-RV” kit No. 1 (“M-Sorb-Tub”) untuk isolasi DNA mikobakteri dari sampel klinis dan sel kultur (pada partikel magnetik)	50	Sintol	PCR waktu nyata	OM-505
Kumpulan reagen "DNA-Extran-1" untuk isolasi DNA genom dari darah utuh	100	Sintol	PCR waktu nyata	EX-509-100
Kumpulan reagen "DNA-Extran-2" untuk ekstraksi DNA dari jaringan hewan dan manusia	100	Sintol	PCR waktu nyata	MANTAN-511
Kumpulan reagen "DNA-Extran-3" untuk ekstraksi DNA dari kultur bakteri	100	Sintol	PCR waktu nyata	EX-512-100
Kumpulan reagen "DNA-Extran-3" untuk ekstraksi DNA dari jaringan tanaman	100	Sintol	PCR waktu nyata	EX-513-100
Kumpulan reagen “K-Sorb” untuk isolasi total DNA pada kolom (dari darah, air liur, urin, kultur sel, kerokan sel epitel)	100	Sintol	PCR waktu nyata	EX-514-100
	48 reaksi	Sintol	PCR waktu nyata	GM-443-48
Set reagen “penyaringan Soya / 35S+FMV / NOS”	50 reaksi	Sintol	PCR waktu nyata	GM-416-50

""DNA-sorb-S-M" ® AmpliSens FBUN Institut Penelitian Pusat Epidemiologi Rospotrebnadzor, Hanya untuk penelitian Federasi Rusia, 111123, dan tujuan non-medis lainnya, Moskow, ..."

INSTRUKSI

tentang penggunaan kit reagen

untuk ekstraksi DNA dari bahan biologis

"DNA-sorb-S-M"

AmpliSense

Lembaga Penelitian Pusat Epidemiologi FBUN

Rospotrebnadzor,

Untuk tujuan penelitian saja

Federasi Rusia, 111123,

dan tujuan non-medis lainnya

Kota Moskow, jalan Novogireevskaya, gedung 3A

DAFTAR SINGKATAN

TUJUAN

PRINSIP METODE

BENTUK PENYELESAIAN

EKSTRAKSI DNA DARI BAHAN BIOLOGIS DARI HEWAN................ 8

PAKAN HEWAN ATAU BAHAN BAKU TUMBUHAN

SIMBOL YANG DIGUNAKAN DALAM PRODUK CETAK

Formulir 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / halaman 2 dari 15

DAFTAR SINGKATAN

Dalam manual ini, singkatan dan simbol berikut digunakan:

DNA – asam deoksiribonukleat NA – asam nukleat OK – kontrol ekstraksi negatif NCO – sampel kontrol negatif PC – kontrol ekstraksi positif PKO – sampel kontrol positif PCR – reaksi berantai polimerase

– Lembaga Ilmu Pengetahuan Anggaran Federal

Lembaga Penelitian Pusat FBUN

"Lembaga Penelitian Pusat Epidemiologi Epidemiologi" dari Layanan Federal untuk Pengawasan di Bidang Rospotrebnadzor untuk Perlindungan Hak Konsumen dan Kesejahteraan Manusia

TUJUAN

Kit reagen DNA-sorb-S-M ditujukan untuk ekstraksi DNA dari bahan biologis hewan: bahan jaringan (biopsi (kulit dan selaput lendir sistem genitourinari, saluran pencernaan, bronkus), bahan bedah dan otopsi); dan ekstraksi DNA dari makanan, bahan tambahan biologis, pakan ternak atau bahan nabati untuk penelitian selanjutnya menggunakan reaksi berantai polimerase (PCR).

Ekstraksi DNA merupakan prosedur praanalisis dari metode PCR.

Volume sampel uji untuk ekstraksi: 100 µl (sampel dengan volume 10 hingga 100 µl atau berat 10 hingga 100 mg diperbolehkan)1.

PERHATIAN! Untuk informasi tentang prosedur pengumpulan, kondisi pengangkutan dan penyimpanan bahan uji, kebutuhan dan prosedur persiapannya untuk ekstraksi DNA, serta informasi tentang zat pengganggu dan batasan yang terkait dengan sampel, lihat petunjuk kumpulan reagen. digunakan untuk amplifikasi.

PRINSIP METODE

Sampel uji2 diolah dengan larutan lisis yang mengandung proteinase K, yang mengakibatkan kerusakan membran sel dan pelepasan NK dan komponen seluler. NC terlarut mengikat partikel sorben, sementara komponen lain dari bahan uji yang dilisiskan tetap berada dalam larutan dan dihilangkan selama pengendapan sorben. Tergantung pada bahan yang diuji, lihat instruksi untuk kit reagen amplifikasi yang digunakan.

Beberapa jenis bahan biologis memerlukan langkah persiapan sampel. Cm.

instruksi untuk kit reagen yang digunakan untuk amplifikasi.

Formulir 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / halaman 3 dari 15 dengan sentrifugasi dan pencucian selanjutnya dari sorben. Ketika buffer elusi ditambahkan ke sorben, NC berpindah dari permukaan silika ke dalam larutan, yang dipisahkan dari partikel sorben melalui sentrifugasi. Sebagai hasil dari prosedur ini, diperoleh sediaan NA yang sangat murni, bebas dari penghambat reaksi amplifikasi, yang menjamin sensitivitas analitik yang tinggi dari studi PCR.

BENTUK PENYELESAIAN

Kit reagen tersedia dalam 2 konfigurasi:

Formulir 1 mencakup satu set reagen “DNA-sorb-S-M” pilihan 50.

Formulir 2 mencakup satu set reagen “DNA-sorb-S-M” versi 100.

INFORMASI PENCEGAHAN DAN PEMBUANGAN

Saat mempelajari bahan biologis dari hewan, pekerjaan harus dilakukan sesuai dengan aturan Kementerian Pertanian dan Perminyakan Federasi Rusia tanggal 27 Januari 1997 No. 13-7-2/840 “Aturan untuk melakukan pekerjaan di bidang diagnostik laboratorium menggunakan metode reaksi berantai polimerase. Ketentuan Pokok”, disetujui oleh Departemen Kedokteran Hewan.

Pada saat mempelajari produk pangan, bahan tambahan hayati, pakan ternak atau bahan baku nabati, pekerjaan harus dilakukan sesuai dengan persyaratan pedoman MU 1.3.2569-09 “Organisasi kerja laboratorium yang menggunakan metode amplifikasi asam nukleat saat bekerja dengan bahan yang mengandung mikroorganisme kelompok patogenisitas I–IV " dan GOST R 53214-2008 "Produk makanan. Metode analitik untuk mendeteksi organisme hasil rekayasa genetika dan produk turunannya.

Persyaratan dan definisi umum."

Saat bekerja, Anda harus selalu mematuhi persyaratan berikut:

– Proses laboratorium harus searah. Analisis dilakukan di ruangan (zona) terpisah. Pekerjaan harus dimulai di Zona Ekstraksi dan dilanjutkan di Zona Amplifikasi dan Deteksi. Jangan mengembalikan sampel, peralatan, atau reagen ke area di mana langkah proses sebelumnya dilakukan.

– Reagen yang tidak terpakai, reagen kadaluwarsa, serta Formulir 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / halaman 4 dari 15 reagen bekas, kemasan3, bahan biologis, termasuk bahan, instrumen dan barang yang terkontaminasi bahan biologis , harus dibuang sesuai dengan persyaratan SanPiN 2.1.7.2790-10 “Persyaratan sanitasi dan epidemiologis untuk pengelolaan limbah medis”.

– Gunakan dan ganti tip sekali pakai untuk pipet filter otomatis pada setiap pengoperasian4. Peralatan plastik sekali pakai wajib dibuang pada wadah khusus yang berisi disinfektan yang dapat digunakan untuk mendisinfeksi limbah medis.

– Piring (mortir dan alu) dan instrumen logam (pisau bedah, gunting, pinset, alat blender, dll.) yang digunakan untuk persiapan awal sampel disimpan dalam larutan desinfektan (misalnya, larutan garam natrium asam dikloroisosianurat 0,2%) untuk satu jam, dicuci dengan air keran dengan deterjen surfaktan dan, setelah dicuci dengan air mengalir dan deionisasi, dikeringkan dalam oven panas kering selama 4 jam pada suhu 180 C.

– Kit reagen dimaksudkan untuk sekali pakai untuk melakukan studi terhadap jumlah sampel yang ditentukan (lihat bagian “Komposisi”).

– Kit reagen siap digunakan sesuai dengan petunjuk ini.

Gunakan kit reagen hanya untuk tujuan yang dimaksudkan.

– Jangan gunakan kit reagen jika kemasan internal rusak atau tampilan reagen tidak sesuai dengan deskripsi.

– Jangan gunakan kit reagen jika kondisi pengangkutan dan penyimpanan sesuai petunjuk tidak diikuti.

Reagen yang tidak terpakai, reagen kadaluwarsa, reagen bekas, kemasan termasuk dalam kelas bahaya limbah medis G.

Tip sekali pakai tanpa filter digunakan untuk menghilangkan supernatan selama proses ekstraksi menggunakan aspirator vakum.

Formulir 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / halaman 5 dari 15

– Jangan gunakan kit reagen setelah tanggal kedaluwarsa.

– Gunakan sarung tangan sekali pakai bebas bedak, jas laboratorium, dan pelindung mata saat menangani sampel dan reagen. Cuci tangan Anda dengan bersih setelah selesai bekerja. Semua pengoperasian dilakukan hanya dengan sarung tangan untuk menghindari kontak dengan tubuh manusia.

– Hindari menghirup uapnya, kena kulit, mata dan selaput lendir, jangan ditelan. Jika terjadi kontak, segera bilas area yang terkena dengan air dan, jika perlu, dapatkan bantuan medis.

– Lembar data keselamatan reagen (SDS – lembar data keselamatan) tersedia berdasarkan permintaan.

Penilaian terhadap kemungkinan kejadian yang dapat mengakibatkan akibat negatif bagi tubuh manusia:

Jika digunakan sebagaimana mestinya dan tindakan pencegahan di atas diikuti, kontak dengan tubuh manusia tidak akan terjadi.

Dalam situasi darurat, hal berikut mungkin terjadi:

– iritasi pada selaput lendir mata pada orang yang sensitif,

– iritasi kulit pada orang sensitif,

- reaksi alergi,

– bahaya jika terhirup,

- Berbahaya jika dikonsumsi secara oral.

Efek spesifik dari kit reagen pada tubuh manusia:

– Tidak ada efek karsinogenik.

– Tidak ada efek mutagenik.

– Tidak ada toksisitas reproduksi.

BAHAN DAN PERALATAN TAMBAHAN

(menunjukkan produsen/pemasok):

1. 1,5 dan 5,0 mL tabung polipropilen sekali pakai yang disekrup atau ditutup rapat (misalnya, Axygen, Inc.

("Exigen, Inc"), AS, atau sejenisnya).

2. Tip sekali pakai untuk pipet volume variabel dengan filter hingga 200 dan hingga 1000 μl (misalnya, Axygen, Inc., USA, atau sejenisnya).

3. Tip sekali pakai untuk pipet dengan volume bervariasi hingga 200 μl (misalnya, Axygen, Inc., USA, atau sejenisnya).

Formulir 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / halaman 6 dari 15

4. Rak untuk tabung 1,5 ml (misalnya Axygen, Inc., USA, atau sejenisnya).

5. Kap aliran laminar, keamanan biologis kelas II tipe A (misalnya, “BAVp-01-“Laminar-S”-1,2”, JSC “Laminar Systems”, Rusia, atau sejenisnya).

6. Termostat untuk tabung Eppendorf dari 25 hingga 100 °C (misalnya, SIA Biosan, Latvia, atau sejenisnya).

7. Pengocok termostat untuk tabung Eppendorf dari 25 hingga 100 °C (misalnya, TS-100, SIA Biosan, Latvia, atau sejenisnya).

8. Microcentrifuge untuk tabung Eppendorf dengan kecepatan sentrifugasi maksimum minimal 12 ribu g (misalnya MiniSpin, Eppendorf (Eppendorf Manufacturing Corporation), Manufacturing Corporation Germany, atau sejenisnya).

9. Vortex (misalnya SIA Biosan, Latvia, atau sejenisnya).

10. Aspirator vakum medis dengan labu perangkap untuk menghilangkan cairan supernatan (misalnya, “OM-1”, LLC “Utes”, Rusia, atau sejenisnya).

11. Dispenser volume variabel otomatis (misalnya, Biohit LLC, Rusia, atau serupa).

12. Kulkas dari 2 hingga 8 °C dengan freezer dari minus 24 hingga minus 16 C.

13. Pisahkan jubah, topi, sepatu dan sarung tangan sekali pakai sesuai MU 1.3.2569-09.

14. Wadah plastik sekali pakai untuk pembuangan dan inaktivasi bahan.

–  –  –

EKSTRAKSI DNA DARI BAHAN BIOLOGIS DARI HEWAN

2. Pilih tabung polipropilen sekali pakai 1,5 ml dengan sekrup atau tutup yang rapat dalam jumlah yang diperlukan (termasuk kontrol ekstraksi negatif dan positif, jika disediakan untuk studi PCR).

Jika buffer reagen lisis dan larutan pencuci 1 disimpan pada suhu 2 hingga 8 C, endapan dalam bentuk kristal dapat terbentuk.

Formulir 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / halaman 8 dari 15

3. Tambahkan 10 µl BKO6 pada masing-masing tabung (jika disediakan untuk penelitian PCR). Tambahkan 400 μl buffer reagen lisis dan 17 μl reagen lisis ke dalam tabung.

4. Tambahkan 100 μl sampel uji6 ke dalam tabung yang telah disiapkan, menggunakan ujung terpisah dengan filter untuk setiap sampel.

PERHATIAN! 400 μl buffer untuk reagen lisis dan 17 μl reagen lisis dapat ditambahkan ke dalam tabung dengan jumlah sampel uji yang diperlukan dan 10 μl BKO7 dapat ditambahkan di sana (jika disediakan untuk penelitian PCR), menggunakan tip terpisah dengan sebuah penyaring.

5. Tambahkan 100 μl NCO ke dalam tabung ekstraksi kontrol negatif (NC), tambahkan 90 μl NKO dan 10 μl PCO ke dalam tabung ekstraksi kontrol positif (PC) (jika kontrol ekstraksi disediakan untuk studi PCR).6

6. Tutup rapat, aduk rata dan kocok tetesannya.

Tempatkan tabung dalam termostat dengan suhu 64 °C selama 1 jam, aduk secara berkala dengan pusaran (5 kali setiap 10–12 menit). Inkubasi diperbolehkan selama 12 jam pada suhu 60°C.

7. Pelet partikel sampel yang tidak larut dengan cara sentrifugasi selama 5 menit pada 10 ribu g (misalnya, 12 ribu rpm untuk mikrosentrifugasi MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

8. Ambil cairan supernatan dalam volume 200–350 μl dengan sangat hati-hati (hindari partikel tersuspensi dan tetesan lemak) menggunakan ujung terpisah dengan filter dan pindahkan ke tabung baru. Sedimentasikan tetesan tersebut dengan pusaran.

9. Suspensikan kembali sorben universal, aduk kuat-kuat menggunakan pusaran. Tambahkan 25 μl sorben universal yang diresuspensi ke setiap tabung dengan ujung terpisah, tutup rapat.

Campur dengan cara divorteks, diamkan di rak selama 10 menit, aduk setiap 2 menit.

Dimungkinkan untuk mengubah volume sampel uji dan kontrol, lihat instruksi untuk rangkaian reagen yang digunakan untuk amplifikasi.

Formulir 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / halaman 9 dari 15

18.Ulangi prosedur pencucian paragraf berikut. 15–16, buang supernatan seluruhnya.

19. Tempatkan tabung reaksi dengan tutup terbuka ke dalam termostat pada suhu 64 °C selama 5–10 menit untuk mengeringkan sorben universal.

20.Tambahkan 50–100 μl buffer elusi B ke dalam tabung (lihat petunjuk untuk kit reagen amplifikasi yang digunakan).

Campur dengan pusaran sampai sorben tersuspensi kembali sepenuhnya. Tempatkan dalam termostat pada suhu 64 °C selama 5–10 menit, aduk secara berkala (sekali per menit) menggunakan pusaran.

DNA yang dimurnikan dapat disimpan pada suhu 2 hingga 8 °C selama seminggu, pada suhu minus 24 hingga minus 16 °C selama 6 bulan, dan pada suhu tidak melebihi minus 68 °C selama setahun. Untuk melakukan ini, tanpa menangkap sorben, perlu untuk memindahkan cairan supernatan ke dalam tabung reaksi baru.

Formulir 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / halaman 10 dari 15

EKSTRAKSI DNA DARI MAKANAN, TAMBAHAN BIOLOGIS,

PAKAN HEWAN ATAU BAHAN BAKU TUMBUHAN

PERHATIAN! Untuk tata cara penyiapan bahan biologis untuk ekstraksi DNA dan volume sampel uji, lihat petunjuk kit reagen amplifikasi yang digunakan.

1. Hangatkan buffer reagen lisis dan larutan pencuci 1, jika disimpan pada suhu 2 hingga 8 °C, pada suhu 64 °C hingga kristal larut sempurna.

2. Tempatkan tabung 1,5 ml berisi sampel uji yang telah diproses sebelumnya ke dalam rak (volume/kuantitas sampel, lihat petunjuk kit reagen amplifikasi yang digunakan).

3. Siapkan tabung polipropilen sekali pakai berukuran 1,5 mL dengan sekrup atau tutup rapat untuk kontrol ekstraksi negatif (EC). Tambahkan 100 µl OKO ke dalam tabung reaksi.

4. Tambahkan 400 μl buffer untuk reagen lisis dan 17 μl reagen lisis ke dalam tabung reaksi yang berisi sampel uji dan TC.

5. Tutup rapat dengan penutup, aduk rata dan pusaran tetesannya.

Tempatkan tabung dalam termostat dengan suhu 64 °C selama 1 jam, aduk secara berkala dengan pusaran (5 kali setiap 10–12 menit), atau gunakan termostat pengocok.

6. Pelet partikel sampel yang tidak larut dengan cara sentrifugasi selama 5 menit pada 10 ribu g (misalnya, 12 ribu rpm untuk mikrosentrifugasi MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

7. Pilih jumlah tabung polipropilen sekali pakai baru 1,5 ml dengan sekrup atau tutup yang rapat.

8. Suspensikan kembali sorben universal, aduk kuat-kuat menggunakan pusaran. Tambahkan 25 μl sorben universal yang diresuspensi ke setiap tabung dengan ujung terpisah, tutup rapat.

9. Dari tabung dengan sampel yang telah dilisiskan, ambil cairan supernatan dalam volume 200–350 μl dengan sangat hati-hati (hindari masuknya partikel tersuspensi dan tetesan lemak) menggunakan ujung terpisah dengan filter dan pindahkan ke tabung dengan sorben. Campur dengan cara divorteks, diamkan di rak selama 10 menit, aduk setiap 2 menit.

Formulir 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27/12/16 / halaman 11 dari 15

10.Sentrifugasi tabung dalam mikrosentrifugasi selama 1 menit pada 2 ribu g (misalnya, 5 ribu rpm untuk mikrosentrifugasi MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

11. Tanpa menangkap sorben, keluarkan cairan supernatan dari masing-masing tabung dengan ujung terpisah tanpa filter sebanyak 200 μl, menggunakan aspirator vakum.

12.Tambahkan 300 μl larutan pencuci 1 ke dalam tabung reaksi, tutup rapat, dan pusaran sampai sorben universal tersuspensi kembali sepenuhnya.

13.Sentrifugasi tabung dalam mikrosentrifugasi selama 1 menit pada 2 ribu g.

14. Tanpa menangkap sorben, keluarkan cairan supernatan dari setiap tabung dengan ujung 200 μl terpisah tanpa filter, menggunakan aspirator vakum.

15.Tambahkan 500 μl larutan pencuci 2 ke dalam tabung reaksi, tutup rapat, dan pusaran sampai sorben universal tersuspensi kembali sepenuhnya

16.Sentrifugasi tabung dalam mikrosentrifugasi selama 1 menit pada 7 ribu g (misalnya, 10 ribu rpm untuk mikrosentrifugasi MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

17. Tanpa menangkap sorben, keluarkan cairan supernatan dari masing-masing tabung dengan ujung 200 μl terpisah tanpa filter, menggunakan aspirator vakum.

18.Ulangi prosedur pencucian paragraf berikut. 15-16, buang supernatan seluruhnya.

19. Tempatkan tabung reaksi dengan tutup terbuka ke dalam termostat dengan suhu 64°C selama 5-10 menit untuk mengeringkan sorben universal.

20.Tambahkan 50 μl buffer elusi B ke dalam tabung, aduk dengan pusaran hingga sorben tersuspensi kembali sepenuhnya. Tempatkan dalam termostat pada suhu 64 °C selama 5–10 menit, aduk secara berkala (sekali per menit) menggunakan pusaran.

21.Sentrifugasi tabung dalam microcentrifuge selama 1 menit pada 10 ribu g. Supernatan mengandung DNA yang dimurnikan. Sampel siap untuk PCR.

DNA yang telah dimurnikan dapat disimpan pada suhu 2 hingga 8 °C selama seminggu, pada suhu minus 24 hingga minus 16 °C selama 6 bulan, dan pada suhu Form 1: REF K1-6-50-Mod / VER 12 /27/16 / halaman 12 dari 15 tidak lebih tinggi dari minus 68 °C sepanjang tahun. Untuk melakukan ini, tanpa menangkap sorben, perlu untuk memindahkan cairan supernatan ke dalam tabung reaksi baru.

HIDUP PENYIMPANAN, KONDISI TRANSPORTASI DAN PENYIMPANAN.

Sebaiknya sebelum tanggal. 12 bulan Kit reagen yang kadaluwarsa tidak dapat digunakan. Tanggal kedaluwarsa reagen yang dibuka sesuai dengan tanggal kedaluwarsa yang tertera pada label untuk reagen yang belum dibuka, kecuali dinyatakan lain dalam petunjuk.

Angkutan. Kit reagen harus diangkut pada suhu 2 hingga 8 C selama tidak lebih dari 5 hari dalam wadah termal yang mengandung elemen dingin, dengan semua jenis kendaraan tertutup. Setelah diterima, bongkar sesuai dengan suhu penyimpanan yang ditentukan.

Penyimpanan. Simpan kit reagen pada suhu 2 hingga 25 C, kecuali untuk reagen lisis. Simpan reagen lisis di lemari es pada suhu 2 hingga 8 C.

Ruang pendingin harus menyediakan kondisi suhu yang dapat diatur.